微生物限度检验仪检验方法
微生物限度检验仪法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。
供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
检查的全过程,均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。
检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。
培养基及其制备方法
除另有规定外，培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。
1.营养琼脂培养基与营养肉汤培养基 见无菌检查法（附录Ⅺ H）。
2.玫瑰红钠琼脂培养基
胨 5g 玫瑰红钠 0.0133g 葡萄糖 10g
琼脂 15～20g 磷酸二氢钾 1g 水 1000ml
硫酸镁 0.5g
除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠，分装，灭菌。
3.酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)
胨 10g 琼脂 15～20g 酵母浸出粉 5g
水 1000ml 葡萄糖 20g
除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖，分装，灭菌。
4.胆盐乳糖培养基(BL)
胨 20g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5g
牛胆盐（或去氧胆酸钠0.5g）2g
氯化钠 5g
水 1000ml
磷酸氢二钾 4.0g
除乳糖、牛胆盐外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，灭菌。
5.曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)
营养琼脂培养基 100ml
曙红钠指示液 2ml
20％乳糖溶液 5ml
亚甲蓝指示液 1.3～1.6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。
6.麦康凯琼脂培养基(MacC)
胨 20g 1%中性红指示液 3ml
乳糖 10g 琼脂 15～20g
牛胆盐 5g 水 1000ml
氯化钠 5g
除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
7.4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide，MUG)培养基
胨 10g 磷酸二氢钾 0.9g 硫酸铵 5g
磷酸氢二钠(无水) 6.2g
酸锰 0.5mg
亚硫酸钠 40mg
硫酸锌 0.5mg
去氧胆酸钠 1g
硫酸镁 0.1g
MUG 75mg
氯化钠 10g
水 1000ml
氯化钙 50mg
除MUG外，各成分溶解于1000ml水中，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解后，每管分装5ml，115℃灭菌20分钟。
8.三糖铁琼脂培养基(TSI)
胨 20g 硫酸亚铁 0.2g 牛肉浸出粉 5g
硫代硫酸钠0.2g 乳糖 10g 硫代硫酸钠 12.5ml
蔗糖 10g 琼脂 12～15g 葡萄糖 1g
水 1000ml 氯化钠 5g
除三糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层(2～3cm)短斜面。
9.四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)
胨 5g 硫代硫酸钠 30g 牛胆盐 1g
水 1000ml 硫酸钙 10g
取上述成分，混合，微温使溶解，灭菌。
临用前，取上述培养基，每10ml加入碘溶液(取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中)0.2ml和亮绿试液0.1ml，混匀。
10.沙门、志贺菌属琼脂培养基(SS)
胨 5g 硫代硫酸钠 8.5g 牛肉浸出粉 5g
中性红指示液 2.5ml
乳糖 10g
亮绿试液 0.33ml
牛胆盐 8.5g
琼脂 20g
枸橼酸钠 8.5g
水 1000ml
枸橼酸铁铵 1g
除乳糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。
11.胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)
胨 20g 枸橼酸钠 1g 牛肉浸出粉 3g
枸橼酸铁铵 1g 乳糖 10g 中性红指示液 3ml
蔗糖 10g 琼脂 18～20g 去氧胆酸钠 1g
水 1000ml 硫代硫酸钠 2.3g
除糖、指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余成分，摇匀，冷至60℃，倾注平皿。
12.溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
胨 10g
溴化十六烷基三甲铵 0.3g
牛肉浸出粉 3g
琼脂 15～20g
氯化钠 5g
水 1000ml
除琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。
13.亚碲酸盐肉汤培养基
临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1%亚碲酸钠(钾)试液0.2ml，混匀，即得。
14.卵黄氯化钠琼脂培养基
胨 6g
10%氯化钠卵黄液 100ml
牛肉浸出粉 1.8g
琼脂 23g
氯化钠 30g
水 650ml
除10%氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.6±0.1，灭菌，待冷至约60℃，以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液，充分振摇，倾注平皿。
10%氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个，以无菌操作取出卵黄，放入10%灭菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。
15.甘露醇氯化钠琼脂培养基
胨 10g
酚磺酞指示液 2.5ml
牛肉浸出粉 1g
琼脂 15～20g
甘露醇 10g
水 1000ml
氯化钠 75g
除甘露醇、指示液及琼脂外，取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。
16.蛋白胨水培养基
胰蛋白胨 10g
水 1000ml
氯化钠 5g
取上述成分，混合，加热溶化，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
17.磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨 7g
磷酸氢二钾 3.8g
葡萄糖 5g
水 1000ml
取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，121℃，灭菌15分钟。
18.枸橼酸盐培养基
氯化钠 5g
枸橼酸钠(无水) 2g
硫酸镁 0.2g
溴麝香草酚蓝指示液 20ml
磷酸氢二钾 1.0g
琼脂 15～20g
磷酸二氢铵 1g
水 1000ml
除指示液和琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀，分装于小试管，灭菌，置成斜面。
注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
19.糖、醇发酵培养基
基础液 胨 10g
0.5%酸性品红指示液 10ml
糖、醇 0.5%
(或溴麝香草酚蓝指示液6ml)
氯化钠 5g
水 1000ml
取胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4，加入指示液，混匀，分装每瓶100ml，121℃灭菌15分钟。
配制葡萄糖发酵培养基时，于100ml基础液加入0.5g葡萄糖，分装于含杜氏管(Durham)的小试管中，121℃灭菌15分钟。配制其他糖、醇发酵培养基时，将各种糖、醇分别配成10%溶液，与基础液同时于121℃灭菌15分钟。以无菌操作将5ml糖、醇溶液加入100ml基础液内，分装于灭菌小试管中。
注：糖、醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。
20.脲(尿素)琼脂培养基
胨 1g
0.2%酚磺酞指示液 6ml
葡萄糖 1g
20%无菌脲溶液 100ml
氯化钠 5g
琼脂 20g
磷酸二氢钾 2g
水 1000ml
除脲和琼脂外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化并分装于锥形瓶，灭菌，冷至50～55℃，加入无菌脲溶液，混匀，分装于灭菌试管中，置成斜面。
21.氰化钾培养基
胨 3g
磷酸氢二钠 5.64g
氯化钠 5g
氰化钾试液 15ml
碳酸二氢钾 0.225g
水 1000ml
除氰化钾试液外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，灭菌，冷却后，加入氰化钾试液，分装于12mm×100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡胶塞塞紧，置4℃保存。同时，以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基，分装于灭菌试管中。
22.赖氨酸脱羧酶试验培养基
胨 5g
1.6%溴甲酚紫指示液 1ml
酵母浸出粉 3g
L-赖氨酸(DL-赖氨酸) 0.5(1)g
葡萄糖 1g
水 1000ml
除赖氨酸外，取上述成分，混合，加热溶解后，加入L-赖氨酸(DL-赖氨酸)，调节pH值使灭菌后为6.8，同时以不加赖氨酸培养基作为对照。分装于灭菌的小试管内，每管2.5ml并滴加一层液体石蜡，121℃灭菌10分钟。
23.绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂)
胨 20g
甘油 10ml
氯化镁(无水) 1.4g
琼脂 18～20g
硫酸钾 10g
水 1000ml
取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，置成斜面。
24.明胶培养基
胨 5g
明胶 120g
牛肉浸出粉 3g
水 1000ml
取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，随时搅拌，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
25.硝酸盐胨水培养基
胨 10g
亚硝酸钠 0.5g
酵母浸出粉 3g
水 1000ml
硝酸钾 2g
取胨和酵母浸出粉加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解，混匀，分装于含杜氏管的小试管，灭菌。
试药牛肉浸出粉 Beef extract powder
本品为米色粉末，在水中溶解。
牛胆盐 Ox bile salt
本品为淡黄色或黄棕色粉末，味苦而甜，具吸湿性，在水和醇中易溶。
玫瑰红钠(四氯四碘荧光素钠) Rose bengal〔C20H2Cl4Na2O5=1017.6〕本品为棕红色粉末。在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，溶液为棕色。
枸橼酸铁铵 Ammonium ferric citrate〔C12H22FeN3O14=488.16〕
本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易潮解，见光易还原成亚铁。在水中溶解，在醇和醚中不溶。
胰蛋白胨 Tryptone
本品为米黄色粉末，在水中溶解。
液状石蜡 Paraffin liquid
本品为无色油状液体。在水和醇中不溶，能与醚、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油类相混溶。
DL-赖氨酸 DL-Lysine〔C6H14N2O2=146.19〕
本品为白色结晶，极易潮解。在水中溶解。
L-赖氨酸 L-Lysine〔C6H14N2O2=146.19〕
本品为白色针状结晶，在空气中易吸收二氧化碳。在水中易溶，在醇中微溶，在醚中不溶。
酸性品红 Fuchsin acid〔C20H17N3Na2O9S3=585.54〕
本品为绿色有金属光泽的颗粒或深红色粉末。在水中溶解，在醇中不溶。
磷酸二氢铵 Ammonium dihydrogen phosphate〔NH4H2PO4=115.03〕
本品为无色结晶或白色结晶性粉末。在水中溶解，在乙醇中不溶。
试液二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml，即得。需新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。
无菌对氨基苯甲酸试液 取对氨基苯甲酸0.1g,加入含10ml水的带塞试管中，121℃灭菌20分钟。
亚碲酸钠(钾)试液 取亚碲酸钠(钾)0.1g，加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。
玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠试液0.1g，加水使溶解成75ml。
无菌枸橼酸钠-氯化钠试液 取枸橼酸钠0.5g，加0.9%氯化钠溶液10ml，121℃灭菌20分钟。
草酸铵试液 取草酸铵1g，加水溶解使成100ml。
亮绿试液 取亮绿0.1g，加水100ml使溶解。
氢氧化钾试液 取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。
盐酸试液 取盐酸8.4ml，加水稀释成100ml。
α-萘酚乙醇试液 取α-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。
氰化钾试液 取氰化钾0.5g，加水溶解使成100ml。
氯化三苯四氮唑试液 取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解使成10ml。
靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。
稀释剂0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟。
无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液 取1ml聚山梨酯80，加0.9%氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。
无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。
指示液
中性红指示液 取中性红1.0g，研细，加95％乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。
变色范围 pH6.8～8.0（红→黄）。
甲基红指示液 取甲基红0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。
亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。
酚磺酞指示液 取亚甲蓝0.5g，加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。
变色范围 pH6.8～8.4（黄→红）。
溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g，加95％乙醇溶解使成100ml。
变色范围 pH5.2～6.8（黄→紫）。
溴麝香草酚蓝指示液 取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。
变色范围 pH6.0～7.6（黄→蓝）。
酸性品红指示液 取酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第2滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。
变色范围 pH6.0～7.4(黄→红)。
曙红钠指示液 取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。
供试品的检验量 每批供试品检验量一般为10g或10ml。化学膜剂为100cm2，贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。
供试品须取自2个以上的包装单位，大蜜丸、膜剂除须取自2个以上的包装单位外，应取自4丸(片)以上样品。
供试液的制备
按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。
1.液体供试品 取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。油剂可加适量聚山梨酯80；气雾剂以适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，再稀释成100ml作为供试液；合剂(系指含王浆或蜂蜜者，下同)与滴眼剂可用供试品作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠液供试品 称取供试品10g,置0.9％无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀后，作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。
(1)非水溶性供试品 取供试品5g(5ml),加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶液约80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液(1∶20)。
(2)不溶于水的膜剂供试品 取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），浸泡，振摇，作为供试液。
(3)肠溶胶囊（片）供试品 称取供试品10g,置含无菌磷酸盐缓冲液(pH6.8)100ml的锥形瓶内，于45℃水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。
3.含抑菌成分供试品 供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。
(1)稀释法 将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
(2)离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心(每分钟3000转)30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心(每分钟500转)5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。
(3)薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45μm±0.02μm微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50～100ml，取出滤膜备检。
(4)中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。
对照用菌液
控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。对照菌株为大肠杆菌〔CMCC(B) 44 102〕、沙门菌〔CMCC(B) 50 094〕、铜绿假单胞〔CMCC(B) 10 104〕及金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕。
取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18～20小时后，稀释至1∶106。对照菌的加入量为50～100个。
检查法
1.细菌、霉菌与酵母菌计数
(1)平皿菌落计数法 取均匀供试液，进一步稀释成1∶102、1∶103等适宜的稀释级。
分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释级应作2～3个平皿。
营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌计数。在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。合剂用玫瑰红钠琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基分别测定霉菌、酵母菌菌落数，合并计数。液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基同时点计霉菌菌落数及酵
母菌菌落数。
菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板，培养，检查，不得长菌。
细菌培养时间为48小时，分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以48小时菌落数为准，霉菌、酵母培养时间为72小时，分别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。菌落如蔓延生长成片，不宜计数。
点计后，计算各稀释级的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在30～300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30～100之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。如有1个稀释级在30～300(30～100)之间时，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30～300(30～100)之间时，按下式计算两级比值。
当比值≤2时，以两稀释级的均值报告，当比值＞2时，以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30～300之间时，以后2个稀释级计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在300(100)以上，按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。如当1∶10(或1∶100)稀释级平均菌落数等于或大于原液(或1∶10)稀释级时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。
(2)培养基稀释法 取供试液（原液或1∶10、1∶100供试液）3份，每份各1ml,分别注入5个平皿内（每皿各0.2ml）。每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。每1ml注入的5个平板的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得3组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个。
2.控制菌检查 除另有规定外，取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2），直接或处理后接种，经增菌、分离培养后，进行革兰染色、生化试验与血清凝集试验等项检查。
(1)大肠杆菌(Escherichia coli) 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml,2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50～100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18～24小时（必要可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5ml MUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴
靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。
如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养18～24小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选2～3可疑菌落作靛基质试验(I)、甲基红试验(M)、乙酰甲基甲醇生成试验(V-P)、枸橼酸盐利用试验(C)及革兰染色、镜检，按表1规定判断结果。
靛基质试验(I) 取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
甲基红试验(M) 取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时±2小时，于管内加入甲基红指示液数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。
乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取可疑菌落或斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时±2小时，于每2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾溶液0.4ml，充分振摇，在4小时内出现红色为阳性，无红色反应为阴性。
枸橼酸盐利用试验(C) 取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养48～72小时，培养基斜面有菌落生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变为阴性。
结果判断见表1。对与MUG-Ⅰ反应不符的可疑菌株(见注①、②)，应重新分离培养，再作生化试验证实。
表 1 MUG的结果判断
MUG-Ⅰ 曙红亚甲蓝琼脂 IMVic 结果
+ + 检出大肠杆菌
- - 未检出大肠杆菌
+ - 无菌生长 未检出大肠杆菌
+ - 有菌生长 -+--① 检出大肠杆菌③
- + 有菌生长 ++--② 检出大肠杆菌③
注：①、②如①出现++--或②出现-+--，均应重新分离菌株，再作MUG-Ⅰ和IMVic试验。③革兰阴性杆菌。
(2)沙门菌(Salmonella apecies) 取营养肉汤培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18～24小时，阴性对照应无菌生长。取其余2份培养物各1ml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10ml中，培养18～24小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上，培养18～24小时或延至40～48小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于表2所列特征时，可判为未检出沙门菌。
如供试品平板生长的菌落特征有与表2所列菌落形态特征相符或疑似者，均应挑选2～3个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上，阳性对照同时接种该培养基，培养18～24小时后，阳性对照的斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品的疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门菌。否则，应继续做以下试验。
表 2 沙门菌菌落形态特征
培 养 基 菌 落 形 态
胆盐硫乳琼脂 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或
全部黑色或无黑色
沙门、志贺菌属琼脂 无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心
有时带黑褐色
曙红亚甲蓝琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的
圆形菌落
麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心
有时为暗色
靛基质试验 照大肠杆菌项下操作并判断结果。
脲酶试验 取疑似菌斜面培养物接种于脲琼脂培养基斜面，培养24小时，斜面变为红色为阳性，不变色为阴性。
氰化钾试验 取培养20～24小时的疑似菌株营养肉汤培养液，分别用白金耳沾取1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基，立即以橡胶塞塞紧，培养24～48小时，对照管应有菌生长，试验管有菌生长者为阳性，无菌生长为阴性。
赖氨酸脱羧酶试验 取疑似菌斜面培养物分别接种于赖氨酸脱羧酶培养基及对照培养基，培养24～48小时，对照管应为黄色，试验管呈紫色为阳性，呈黄色为阴性。
动力检查 取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，培养24小时，细菌沿穿刺外周扩散生长，为动力阳性，否则为阴性。阴性培养物，应在室温保留2～3天后，再判断。
血清凝集试验 在洁净载玻片一端，以白金耳沾取沙门菌属A～F“0”多价血清2～3环，再取斜面上部的培养物少许，与血清混合，将玻片前后侧动，如出现凝集现象，应以0.9%氯化钠溶液与同株培养物作对照试验，无凝集现象时判为血清凝集阳性。时有反应迟缓，需将玻片与湿棉球置平皿内，约过20分钟，再观察。仍未出现凝集时，应取斜面培养物，置含少量0.9%氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30分钟，待
冷，再作凝集试验。如出现凝集，应判为阳性，否则为阴性。
上述各项试验反应，一般应为硫化氢阳性(或阴性)，靛基质阴性，脲酶阴性，氰化钾阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，动力阳性，A～F“0”多价血清凝集试验阳性。各鉴定结果按表3判定。
表 3 沙门菌检查结果判定
序 号 血清凝集试验（A-F“0”血清） 生化试验 结 果
凝集反应 100℃30分钟 0.9%氯化钠
凝集反应 溶液对照
1 阳性 阴性 符合 检出沙门菌
2 阴性 阳性 阴性 符合 检出沙门菌
3 阴性 阴性 不符合 未检出沙门菌
上述各项试验任何一项不符合或有可疑反应的培养物，均应进一步鉴定后作出结论。
(3)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18～24小时，阴性对照应无菌生长，其余2份培养液划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养18～24小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落或无疑似菌落生长，可判未检出铜绿假单胞菌。
铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如生长菌落具有上述特征或疑似者，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取培养物革兰染色，并做氧化酶试验。
氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
如证实为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。
绿脓菌素(Pyocyanin)试验 取上述琼脂培养物，接种于绿脓菌素测定用培养基斜面上，培养24小时后，在试管内加氯仿3～5ml，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将氯仿移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。试验同时应作阴性对照。
当阴性对照试验呈阴性时，并为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素阳性，可判检出铜绿假单胞菌。
绿脓菌素阴性的培养物，应继续做以下试验。
硝酸盐还原产气试验 取营养琼脂培养基斜面培养物，接种于硝酸盐胨水培养基中，培养24小时，如在培养基的杜氏管中有气体产生，即为阳性。
42℃生长试验 取营养琼脂培养基斜面培养物于0.9％无菌氯化钠溶液中，制成菌悬液，再将菌悬液接种于营养琼脂培养基斜面，立即置41℃±1℃水浴中培养24～48小时，有菌苔生长者为阳性，否则为阴性。
明胶液化试验 以接种针沾取营养琼脂培养基斜面培养物，穿刺于明胶培养基内，培养24小时，取出置冰箱内10～30分钟。如培养基仍呈溶液状，为阳性。
当为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性、绿脓菌素试验阴性，其硝酸盐还原产气试验、42℃生长试验及明胶液化试验均为阳性时，应判检出铜绿假单胞菌。
(4)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基3份，每份100ml,2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作为阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。均培养18～24小时（必要时可延至48小时）。
阴性对照应无菌生长。取其余2份培养液划线接种于卵黄高盐琼脂培养基平板或甘露醇高盐琼脂培养基平板，培养24～72小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板如无菌落生长，或有菌落但不同于表4所列特征，可判未检出金黄色葡萄球菌。
表 4 金黄色葡萄球菌菌落形态特征
培养基 菌落形态
卵黄高盐琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵
磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1-2mm
甘露醇高盐琼脂 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄
色环，菌落直径0.7-1mm
如有菌落生长并与表4所列特征相符或疑似时，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时，取其培养物革兰染色，并作血浆凝固酶试验。
血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，各加入血浆-无菌水(1∶1)0.5ml，1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml,1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照，另1支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。将3管同时培养。3小时后开始检查，以后适当时间逐次观察直至24小时。阴性对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。
当阴性对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性时，判定为检出金黄色葡萄球菌。
结果判断
细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。
细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数第一次测定超过该品种微生物限度项下规定时，应从同一批号样品中随机抽样，复试2次，如3次结果平均值报告。
眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判供试品合格。
如营养琼脂培养基平板生长霉菌（酵母菌）菌落数或玫瑰红钠琼脂培养基平板生长细菌菌落数超过该品种微生物限度项下规定时，经复试2次，如3次结果平均值仍超过规定，应判供试品不合格。
各类制剂检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再抽样复试，即应判该供试品不合格。
表 5 微生物限度标准(单位：个/g或个/ml)
编号 剂 型 细菌数 霉菌、 大肠杆菌 铜绿假单胞菌
酵母菌数 金黄色葡萄球菌
1 片剂 1000 100
2 酊剂 100 100
3 栓剂 100 10
4 胶囊剂 1000 100
5 软膏剂 100 100
6一般眼膏剂 100
7一般滴眼剂 100
8丸剂（滴丸、
糖丸等） 1000 100
9 气雾剂 100 10
10 糖浆剂 100 100
11 膜剂 100/10cm2 100/10cm2
12 颗粒剂 1000 100
13口服溶液
剂、混悬剂
、乳剂 100 100
14 散剂 1000 100
外用散剂 100 100
15 滴耳剂 100 10
16 滴鼻剂 100 10
17 洗剂 100 100
18 搽剂 100 100
19 凝胶剂 100 100
注：“—”为每1g或每1ml中不得检出。
说明：
1.含动物组织来源的制剂(包括提取物)，还不得检出沙门菌。
2.抗细菌的口服抗生素制剂应检查霉菌，每1g中不得过100个；抗真菌的口服抗生素制剂应检查细菌，每1g中不得过100个。
3.霉变、长螨者，以不合格论。
